Проверьте зрение за 5 минут, не отходя от компьютера →
Поделиться  →

Гистологическая обработка материала

Из обрабатываемого материала наибольший интерес для офтальмолога представляют энуклеированные глаза. При фиксации и дальнейшей обработке глазного яблока необходимо учитывать посмертные (в данном случае применительно только к глазу) изменения. Особенно значительные посмертные изменения и в короткий срок возникают в нервных клетках сетчатой оболочки (как и вообще во всех нервных клетках), поэтому фиксация должна быть немедленной. Для этого склянка с фиксирующей жидкостью должна быть в операционной.

Исследование кусочков тканей глаза или содержимого орбиты проводится соответственно общим правилам патологической анатомии. Для получения серийных срезов глаза глазное яблоко должно быть тщательно ориентировано, т. е. необходимо определить, где верхний и нижний концы вертикального меридиана и где наружный и внутренний концы горизонтального меридиана.

Желательно ориентировать также кусочки, что значительно облегчает в дальнейшем чтение препаратов. Для ориентации оставляют на склере глазного яблока небольшой кусочек сухожилия наружной прямой мышцы.

В тех случаях, когда лаборатория получает глаз безо всяких ориентиров, но известно, какой это глаз, правый или левый, можно провести ориентацию, учитывая расположение зрительного нерва и неодинаковое место прикрепления наружных прямых мышц: зрительный нерв выходит из глазного яблока несколько ближе к носу, а наиболее близко к лимбу располагается сухожилие внутренней прямой мышцы.

Фиксирующие жидкости

Фиксирующие жидкости должны предотвращать посмертные изменения, а также фиксировать структуру ткани. Действие фиксирующих жидкостей на различные ткани неодинаково. В значительной мере определяет наш выбор фиксирующей жидкости то, какие структуры тканей мы хотим выявить.

В фиксирующих жидкостях, объем которых должен в 20–25 раз превышать объем фиксируемого материала, глаз лучше подвешивать за остаток сухожилия, кусочки тканей удобно завернуть в один слой марли и тоже держать в подвешенном состоянии.

Учитывая, что склера является некоторой преградой для проникновения фиксирующей жидкости, рекомендуется шприцем вводить в стекловидное тело небольшое количество фиксирующего раствора.

Наиболее широко применяемыми фиксирующими жидкостями являются 10% раствор формалина и жидкость Ценкера.

а) Формалин поступает в продажу в виде 40% водного раствора формальдегида. Формалин имеет кислую реакцию, в связи с чем он непригоден для фиксации, особенно нервной ткани. Нейтрализация формалина производится с помощью мела, а еще лучше — углекислой магнезии, для чего на дно бутылки с формалином насыпают порошок толщиной 3–4 см и взбалтывают. Обычно через сутки раствор формалина становится нейтральным. Раствор формалина нужно готовить на водопроводной воде, так как дистиллированная вода ведет к набуханию тканей. Однако при импрегнации серебром соли железа, которые всегда находятся в водопроводной воде, могут явиться существенной помехой и значительно снизить качество препаратов.

Длительность фиксации глаза в формалине 1–2 суток, кусочков — несколько часов. Единственным недостатком формалина как фиксирующей глаз жидкости является то, что он вызывает набухание коллоидов стекловидного тела, что приводит к некоторому сдавлению сосудистой оболочки. После фиксации в формалине глаз нужно промыть водой и тогда его можно хранить бесконечно долго в 70° спирте.

б) Жидкость Ценкера — хороший фиксатор глазного яблока. Приготовление жидкости Ценкера: растворяют 5 г сулемы, 2 г двухромовокислого калия, 1 г сернокислого натрия в 100 мл дистиллированной воды. Жидкость Ценкера следует хранить в темноте. Перед употреблением к фиксатору добавить 5 г ледяной уксусной кислоты.

Фиксация глаз продолжается в темноте 6–8 часов, после чего объект промывают в проточной воде в течение 24–36 часов. Затем глаз помещают в 70° спирт, куда добавляют по каплям 10% йодную настойку до получения цвета крепкого чая. При помощи йодирования, которое производится в темноте, на протяжении 3–5 дней достигается удаление сулемы из ткани.

Фиксация в жидкости Ценкера непригодна для изучения нервных волокон, что в значительной мере уменьшает ее положительное качество.

в) Хорошим фиксатором (Вергоф) для тканей глазного яблока является следующая смесь: формалина 10 мл (40°), 95° спирта 48 мл, пикриновой кислоты 1 мл, воды 36 мл. Глаз оставляют в этой жидкости на 48 часов, а затем, минуя промывание, переносят прямо в 70° спирт. При этом методе форма яблока сохраняется очень хорошо, без отслаивания сетчатой оболочки, как и в жидкости Ценкера.

Подготовка материала к заливке

Для окраски и гистологического изучения срезов последние должны иметь толщину 10–20 ?. Чтобы получить такой тонкий срез на микротоме, блок, в который заключен исследуемый материал, должен иметь однородную, плотную консистенцию. Прежде чем заливать материал в целлоидин или парафин, его необходимо промыть от фиксатора, а потом тщательно обезводить. После фиксации в формалине или жидкости Ценкера промывка глаза в проточной воде должна длиться около 24 часов.

Если предполагается импрегнировать препарат серебром, следует после промывки его в проточной воде, в течение 5–6 часов промывать в дистиллированной воде, чтобы удалить соли железа. Кусочки тканей промывают на протяжении 3–4 часов.

Следующий этап после промывки — тщательное обезвоживание и уплотнение материала в спиртах восходящей крепости. Этот этап очень важен, особенно при обезвоживании глазного яблока, и в этих случаях проводку лучше начать с 50° спирта. При проведении небольших кусочков можно начинать с 70° спирта. Схема обезвоживания для глаз следующая:

  1. 50° спирт;
  2. 60° спирт;
  3. 70° спирт;
  4. 80° спирт;
  5. 90° спирт;
  6. I абсолютный спирт;
  7. II абсолютный спирт;
  8. I абсолютный спирт и эфир (поровну);
  9. II абсолютный спирт и эфир.

В каждой жидкости глаз должен находиться сутки.

Перед заливкой в целлоидин для лучшего пропитывания глаз необходимо разрезать и вскрыть камеры, что производится после обезвоживания в 90° или в I абсолютном спирте.

Горизонтальное направление разреза применяется не во всех случаях: иногда появляется необходимость в вертикальном разрезе, что вызывается положением опухоли, инородного тела, местом операции и т. д.

После разреза все части глаза вновь помещают на сутки в тот же спирт, где глаз был до разреза. Средняя часть исследуется первой; в случае необходимости прибегают к исследованию сегментов. При наличии окостенения, что отмечается в атрофических глазах при разрезе, слышен хруст и нож с трудом режет глаз. Такие глаза нужно декальцинировать. Наиболее удобной жидкостью для декальцинации является водный 5–7% раствор азотной кислоты. Декальцинированный материал надо промыть в проточной воде на протяжении нескольких часов, а затем перенести на 1–2 суток в 20% формалин. Можно перед промыванием нейтрализовать кислоту, помещая на 2–5 минут в воду с прибавлением раствора аммиака (так называемый нашатырный спирт).

Заливка в целлоидин

После окончательного обезвоживания разрезанный глаз переносят на 7 дней в жидкий 2% целлоидин, затем на 5 дней — в 4% густой, а потом на 3 дня — в еще более густой 8% целлоидин. Окончательная заливка густым целлоидином производится в бюксе.

Банки с целлоидином должны закрываться притертыми пробками; при заливке не требуется соблюдать герметичности, так как для уплотнения целлоидина необходимо медленное испарение спирта и эфира. Перед заливкой в целлоидин следует осторожно выжать пузырьки воздуха из передней и задней камер и стекловидного тела. После окончательного уплотнения лишний целлоидин срезают, а блок с препаратом помещают в 70° спирт, где он может сохраняться неограниченное время.

Целлоидин готовят из отмытых, высушенных и мелко нарезанных рентгено- и кинопленок, растворяя последние в равном количестве абсолютного спирта и эфира.

Единственным недостатком при заливке глаз и кусочков в целлоидин является довольно продолжительный срок обработки (около З,5 недель). Попытка сократить этот срок ведет к ухудшению качества срезов. При проводке мелких кусочков (0,5–0,8 см) весь процесс уплотнения и заливки значительно сокращается.

Целлоидиновый блок приклеивается к деревянной колодочке. Перед наклеиванием колодочка должна быть обезвожена и обезжирена. На одну из поверхностей ее наносят ножом насечки, затем наливают слой густого целлоидина толщиной 2,5–3 мм. Поверхность блока, которая должна быть приклеена, опускают на 1–3 секунды в эфир, а затем слегка прижимают к колодке. Спустя 20–30 минут блок пригоден к резке.

При резке на микротоме рекомендуется укреплять блок так, чтобы начало разреза шло со стороны роговицы. Нож следует укреплять косо, чтобы все лезвие ножа проходило через блок. Необходимо при резке обильно увлажнять нож и блок 70° спиртом. Большой выигрыш во времени дает резка материала на замораживающем микротоме: спустя 3/4—1 час можно получать окрашенные срезы. Но получить удовлетворительные срезы через весь глаз на этом микротоме не представляется возможным.

Для ясного пространственного представления о топографических взаимоотношениях глаза, что особенно важно при диагностике, необходимо готовить серийные срезы. С этой целью заготавливают из тонкой, пергаментной бумаги кружки или квадраты размером несколько больше объекта. На края квадратов наносят порядковые номера простым карандашом, начиная с № 1. С помощью бумажных квадратов срезы переносят в чашку с 70° спиртом; каждый 10-й срез откладывают в другую чашку для окрашивания. Если разрезать только центральную часть глаза, будет 170–250 срезов. Пронумерованные бумажные квадраты вместе со срезами складывают в виде пакета и сохраняют как архивный материал в 70° спирте.

Окраска срезов

При окраске происходят между тканями и красками сложные физико-химические процессы. Выявление деталей строения основано на неодинаковых отношениях красителей к разным гистологическим структурам.

Красящие вещества делятся на три группы: основные, кислые и нейтральные. Основные красители представляют основания или их соли; они окрашивают те структуры, которые имеют кислую реакцию. Кислые краски представляют собой кислоты и соли кислот и в основном окрашивают ткани, имеющие щелочную реакцию: протоплазму клеток, парапластические субстанции. Нейтральные красители представляют соединения красящих оснований и солей кислот и окрашивают как ядра, так и протоплазму клеток.

Наряду с окрашиванием находит применение так называемый метод импрегнации тяжелыми металлами: серебром, осмием, золотом и т. д.

Выбор методики окраски зависит от того, какие структуры ткани нужно-выявить.

Ниже мы приводим два наиболее широко применяемых в общей патологии метода окраски, которые незаменимы и в практике офтальмолога.

Окраска гематоксилинэозином

Окраску срезов производят раздельно: в первую очередь окрашиваются ядра в синий цвет гематоксилином, а затем протоплазма эозином.

Для этого:

  1. сначала срезы помещают в специально приготовленный раствор гематоксилина;
  2. затем производят дифференцировку в 0,5% растворе солянокислого спирта,
  3. после этого промывают в воде;
  4. далее окрашивают в слабом растворе эозина в течение 1–2 минут;
  5. обезвоживают в двух 96° спиртах;
  6. просветляют в карболовой кислоте;
  7. заключают в канадский бальзам.

Окраску срезов глаза лучше производить гематоксилином Эрлиха. На срезах, окрашенных этим способом, ядра приобретают сине-фиолетовый цвет. Протоплазма клеток, соединительная ткань, мышцы водным эозином дополнительно окрашиваются в розово-красный цвет.

Окраска по ван Гизону

Этот метод применяется главным образом для выявления соединительной ткани. Соединительная ткань окрашивается в ярко-красный цвет, эпителий и эндотелий — в зеленовато-коричневый, мышечная ткань — в желтый, кровь — в зеленовато-желтоватый. При окраске по ван Гизону нужно пользоваться гематоксилином Вейгерта, который состоит из 1% спиртового раствора 96° спирта и 4% раствора водного полуторахлористого железа, 1 мл крепкой соляной кислоты. Эти растворы смешивают перед окраской.

Методика окрашивания следующая:

  1. после споласкивания срезов в дистиллированной воде перемещение их в гематоксилин Вейгерта на 3–5 минут (при этом их намеренно перекрашивают);
  2. дифференцировка в солянокислом спирте;
  3. повторное споласкивание в воде и перенос в раствор пикрофуксина на 3–5 минут (насыщенный водный раствор пикриновой кислоты — 100 CM3+1% водный раствор кислого фуксина 10 см3).
  4. быстрое проведение через спирты;
  5. просветление в карболовой кислоте и заключение в бальзам.

Что касается других методик окраски (а их чрезвычайно много), то мы приведем только некоторые из специальных методик, применяемых для исследования центральной нервной системы и глаза.

Метод Гольджи в модификации Рамон и Кахала для выявления нервных и глиальных элементов сетчатой оболочки

  1. Свежеэнуклеированный глаз разрезают бритвой по экватору, затем удаляют стекловидное тело и помещают весь задний полюс глаза с сетчатой оболочкой на 1–2 дня в смесь из 20 мл 3% бихромата калия и 5–6 мл 1% раствора осмиевой кислоты.
  2. Осторожно высушивают препарат фильтровальной бумагой и переносят на 24 часа в 0,75% раствор азотнокислого серебра.
  3. Без промывания перекладывают на 24–36 часов в смесь, состоящую из 20 мл 3% бихромата калия и 2–3 мл 1% раствора осмиевой кислоты.
  4. Вновь помещают на 24–48 часов в 0,7% раствор азотнокислого серебра. Затем идет быстрое обезвоживание и заливка в целлоидин.

Выявление нервных элементов сетчатки по Догелю

Свежеэнуклеированный глаз разрезают по экватору и осторожно из задней полусферы глаза извлекают сетчатку с остатками стекловидного тела и помещают на широкое предметное стекло наружной поверхностью кверху. Поверхность сетчатой оболочки смачивают несколькими каплями в 1/6—1/8% растворе метиленовой сини. Спустя 5 минут сетчатую оболочку переносят на чистое предметное стекло внутренней поверхностью кверху и увлажняют объект 1/4—1/8% раствором метиленовой сини. Затем стекло помещают в плотно закрывающуюся плоскую чашку и ставят в термостат на 30–40 минут при температуре 37°. Так как метиленовая синь быстро выцветает, производят фиксацию окраски в течение суток в 5% концентрированном на холоду пикриновокислом аммонии.

Можно фиксировать более быстро (по А. В. Леонтовичу); после отсасывания фильтровальной бумагой избытка красителя материал переносят в 0,15% раствор пикриновокислого аммония, к которому предварительно был добавлен аммиак из расчета 10 капель на 100 мл раствора. Длительность фиксации в этом растворе 3–4 минуты, затем на 3–4 минуты переносят в 2,5% раствор молибденовокислого аммония. Затем кусочки быстро промывают в дистиллированной воде; в последующем — обезвоживание и заливка в целлоидин.

Окраска по Нисслю в модификации П. Е. Снесарева

  1. Тонкие целлоидиновые срезы переносят в 96° спирт и на водяной бане нагревают до кипения спирта.
  2. Затем срез погружают в раствор тионина (1:500) и снова нагревают до появления паров. Иногда для более интенсивного окрашивания срезы оставляют в растворе тионина на несколько часов при комнатной температуре.
  3. После тионина проводят дифференцировку срезов в батарее, состоящей из пяти бюксов, в которые налит 96° спирт. В 3-й бюкс к спирту добавляют эвкалиптовое масло (на 1 мл спирта 1 капля масла). Дифференцировку проводят под контролем микроскопа.
  4. Просветляют в ксилоле и толуоле и заключают в бальзам.

Импрегнация серебром нервных волокон и нервных клеток по Глису

Импрегнация нервных элементов серебром является одним из наиболее трудных и капризных гистологических методов. Импрегнация серебром по Глису выгодно отличается от других подобных методик своим сравнительно «не капризным» характером и достаточно высоким качеством препаратов. После фиксации в формалине делаются срезы на замораживающем микротоме, толщиной в 10–20 микрон. Затем:

  1. После непродолжительного споласкивания в дистиллированной воде в течение 10–15 минут срезы помещают на 3–4 дня в смесь Бодиана (5 мл 40% нейтрального формалина + 5 мл ледяной уксусной кислоты, 90 мл 96° этилового спирта).
  2. Промывают срезы в дистиллированной воде (8–10 бюксов).
  3. Затем срезы помещают на 24 часа в смесь, состоящую из 25 мл 50° спирта (этилового) и 10 капель 25% аммиака.
  4. Вновь срезы промывают в 9–10 бюксах дистиллированной воды и перекладывают в 10% раствор азотнокислого серебра, где они должны находиться от нескольких часов до 3–4 дней, пока не станут коричневыми.
  5. Не споласкивая, срезы переносят в 10% раствор нейтрального формалина (3–4 бюкса), затем промывают в водопроводной воде (3–4 бюкса) и погружают на 4–10 секунд в раствор аммиачного серебра, которое приготавливают следующим образом: к 10 мл абсолютного спирта прибавляют 10 мл 20% раствора азотнокислого серебра (выпадает осадок), который растворяется 25% аммиаком. Раствор аммиака добавляют осторожно, по каплям.
  6. Препарат переносят в 10% раствор нейтрального формалина (3–4 бюкса).
  7. Промывают в дистиллированной воде (3–4 бюкса) и затем проводят золочение препаратов.
  8. Помещают в спирт, ксилол и заключают в бальзам.

Окраска миелиновых волокон по Шпильмейеру

Формалиновая фиксация. Хорошо окрашиваются как целлоидиновые срезы, так и приготовленные на замораживающем микротоме.

  1. После промывки в воде срезы помещают на сутки в 2,5% водный раствор железоаммиачных квасцов.
  2. После промывки в дистиллированной воде срезы переносят на 0,5-1 час в слабый раствор гематоксилина Вайгерта (1 мл гематоксилина на 20–30 мл дистиллированной воды).
  3. Затем промывают в дистиллированной воде и производят дифференцировку в 2,5 % растворе железо-аммиачных квасцов под контролем микроскопа.
  4. Помещают в спирт, ксилол и в заключение в бальзам.

Выявление межуточного вещества сетчатой оболочки по методу Фута

  1. Целлоидиновые срезы (15–20 ?) помещают на 4–6 часов в 5% раствор формалина.
  2. После прополаскивания в воде срезы погружают в 0,25% раствор марганцовокислого калия на 5 минут, до получения желто-коричневого цвета.
  3. Затем срезы переносят на 30 минут в 5% раствор щавелевой кислоты; в нем они постепенно обесцвечиваются.
  4. Промывают дистиллированной водой (меняя воду три раза через 10 минут).
  5. После этого срезы помещают в темноте в 20% раствор азотнокислого серебра на 48 часов; на этом этапе срезы приобретают светло-коричневую окраску.
  6. Срезы быстро (5–7 минут) промывают в дистиллированной воде.
  7. Затем срезы помещают в аммиачное серебро на 30 минут; приготовление аммиачного серебра: 20 мл 10% AgNO, 20 капель 40% NaOH и добавить по каплям 25% раствора аммиака до растворения осадка и 80 мл дистиллированной воды; раствор профильтровать; цвет срезов становится коричневым.
  8. Промывают в дистиллированной воде 3 раза по 10 минут.
  9. Срезы погружают в 5% раствор формалина на 30 минут, где они приобретают темно-коричневую окраску.
  10. Промывают срезы в проточной воде в течение часа.
  11. Производят золочение срезов — в 1% растворе хлорного золота — в течение нескольких секунд, до потемнения среза.
  12. Промывают в дистиллированной воде — три смены по 10 минут.
  13. Срезы переносят на 1/4 минуты в 5% раствор гипосульфита, до серовато-красного оттенка.
  14. Промывают дистиллированной водой (3 раза по 10 минут).
  15. Обезвоживают в спиртах; просветляют в карболовой кислоте и заключают в бальзам.

Для переноски срезов пользуются только стеклянными иглами. При микроскопическом изучении нормальной сетчатой оболочки, окрашенной этим способом, видно негативное ее изображение, так как все тканевые элементы — клетки и волокна — не окрашены, а все промежутки оказываются заполненными мелкодисперсным коллоидным веществом (обнаружено и впервые опубликовано в 1949 г. В. Н. Архангельским). При патологических изменениях межуточное вещество изменяет свой вид раньше, чем тканевые структуры сетчатки.

Иногда при применении специальных методик возникает необходимость в удалении целлоидина. В этих случаях срезы наклеивают на стекло, просушивают и опускают в раствор равных количеств спирта и эфира или в гвоздичное масло. Затем срез высушивают и отмывают абсолютным спиртом, после этого срезы рекомендуется поместить на 1–2 дня в нейтральный формалин.

Патогистологу-офтальмологу иногда приходится исследовать не только глазное яблоко с небольшим участком зрительного нерва, но и внутричерепные участки зрительных нервов, хиазму, зрительные канатики с прилегающими к ним участками головного мозга, в связи с чем овладение специальными нейрогистологическими методиками является необходимым.

Л. С. НОВОХАТСКИЙ

Посвящается моему деду, доктору Фролову В.М. (1939-2014) Не пользуйтесь материалами сайта без консультации специалиста!